摘自《食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)》
范文來,男,研究員,主要從事釀酒工程與發(fā)酵工程方面的研究。
我國(guó)白酒風(fēng)味物質(zhì)研究始于1964年茅臺(tái)酒的第2次試點(diǎn)。1964年10月采用紙上層析法研究醬香型白酒窖底香氣微量成分,當(dāng)時(shí)一個(gè)斑點(diǎn)呈現(xiàn)窖底香,經(jīng)鑒定是己酸乙酯,并進(jìn)行了添加實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。1955年di一臺(tái)商業(yè)化氣相色譜(gas chromatography,GC)出現(xiàn),1967年將GC應(yīng)用于我國(guó)白酒微量成分研究 。1964年Fuller等發(fā)明了氣相色譜-聞香技術(shù)(GC-olfactometry),將GC的化合物分離性能與人的鼻子聞香結(jié)合起來,從此,食品風(fēng)味研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但直到2005年GC-O技術(shù)才應(yīng)用于我國(guó)白酒風(fēng)味研究。筆者曾經(jīng)對(duì)風(fēng)味研究方法及香氣物質(zhì)研究有過回顧,江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物學(xué)及應(yīng)用酶學(xué)研究室的范文來, 徐巖擬回顧GC-O技術(shù)應(yīng)用于白酒研究的方法學(xué),包括總體研究思路、聞香技術(shù)、香氣成分定量技術(shù)以及香氣重組與缺失技術(shù),以期對(duì)酒類香氣成分研究有所啟發(fā)。
1 白酒香氣總體研究思路
白酒香氣研究的方法與食品風(fēng)味研究方法[11-12]類似,但又有其自身特點(diǎn)。主要包括以下幾個(gè)主要方面。
一是香氣物質(zhì)提取。香氣物質(zhì)提取方法目前主要使用的還是經(jīng)典的液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)方法,白酒中大部分香氣物質(zhì)是極性較強(qiáng)的化合物,因而常用萃取劑是乙mi、二氯甲烷、氟利昂或它們的混合物[13-21],當(dāng)然也有使用頂空固相微萃取(head-space solid phase microextraction,HS-SPME)作為樣品提取的方法[6],但由于該方法在萃取物極性方面上的局限,因而較少使用。
白酒LLE的關(guān)鍵是酒精對(duì)萃取物的影響。研究表明,高度白酒必須稀釋后才能有效萃取,稀釋后的酒精度是10%vol~14%vol[6,13-14,18]。
為防止水可能帶入的氣味物,風(fēng)味研究全過程使用的水為超純水(Milli-Q),且將水加熱煮沸5 min,冷卻后使用。
為防止洗滌劑帶入的氣味物,必須使用無味洗滌劑浸泡實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿1~2d,再按常規(guī)方法清洗。清洗后的玻璃器皿再用煮沸冷卻后的超純水洗滌3次,進(jìn)行烘干,不能高溫烘干的材料,常溫晾干。
二是香氣物質(zhì)分離。白酒微量成分含量十分豐富,多達(dá)千種[22-23],已經(jīng)鑒定出的化合物達(dá)698種[23-24]。在聞香過程中,可能會(huì)出現(xiàn)化合物GC峰重疊,造成香氣重疊;或某些化合物香氣太強(qiáng),而掩蓋了香氣較弱的化合物。因此,通常會(huì)將萃取后的有機(jī)相再進(jìn)行分離,或稱為分餾(fractionation)。如將萃取后的有機(jī)相分為酸性組分(acidic fraction,AF)、堿性組分(basic fraction,BF)、水溶性組分(water-soluble fraction,WSF)和中性組分(neutral fraction,NF)[17-18],或分為AF、WSF、中堿性組分(N/BF)[16,21],或分為酸性-水溶性組分(A/WF)和N/BF[13-14,19-20,25-27]。但由于中性組分或中堿性組分仍然比較復(fù)雜,即化合物眾多,此時(shí),還可以采用正相色譜技術(shù)(normal-phase liquid chromatography,NPLC),根據(jù)化合物極性將其再細(xì)分為多個(gè)亞組分(subfraction)[13,18]。如在洋河大曲研究時(shí),N/BF組分化合物多,采用硅膠60(silica gel 60)吸附N/BF組分香氣成分,分別使用V(戊烷)∶V(乙mi)=98∶2、95∶5、90∶10和0∶100混合液洗脫成4個(gè)組分[13]。在進(jìn)行茅臺(tái)酒和郎酒研究時(shí),分別使用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30和0∶100混合液洗脫成6個(gè)組分[18]。在研究藥香型白酒香氣和萜烯類化合物時(shí),將N/BF組分使用硅膠柱分別用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50和0∶100混合液洗脫出7個(gè)組分[19,28]。如此形成的AF或A/WF、BF、NF或N/BF、水溶性組分,或者加上NPLC的亞組分分別進(jìn)行聞香。
三是活性香氣化合物(active-aroma compounds)發(fā)現(xiàn)。一個(gè)特定酒樣中,什么技術(shù)可以檢測(cè)哪一個(gè)化合物對(duì)香氣有貢獻(xiàn)呢?通常認(rèn)為是GC-O技術(shù)[5],又分為精靈分析(CharmAnalysis)法[29]、香氣萃取稀釋分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)法[12,30]、香氣萃取濃縮分析(aroma extract concentration analysis,AECA)法[31]、Osme技術(shù)(Osme techniques)[32]等。這些技術(shù)能檢測(cè)到可能呈香的化合物,再與GC-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-flame ionization detector,GC-FID)或GC-質(zhì)譜檢測(cè)器(GC-mass spectrometry,GC-MS)技術(shù)結(jié)合后,就可以進(jìn)行香氣化合物鑒定。
香氣化合物的鑒定需要使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確認(rèn),即當(dāng)未知化合物香氣特征、色譜保留時(shí)間(retention index,RI)[33]以及質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品*一致時(shí),即可確認(rèn)。通常情況下,需要使用二個(gè)極性不同的色譜柱(如極性和非極性色譜柱)進(jìn)行確認(rèn)[13-14,34-35]。
四是重要活性香氣化合物確認(rèn)。應(yīng)用Charm-Analysis、AEDA和Osme技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)重要的風(fēng)味化合物,但由于檢測(cè)到的這些化合物呈現(xiàn)的是在空氣中的香氣強(qiáng)度,與原白酒樣品中實(shí)際香氣強(qiáng)度有區(qū)別,因此,通常使用氣味活力值(odor activity value,OAV)的大小來表征其重要程度。OAV是指氣味化合物濃度與其對(duì)應(yīng)介質(zhì)中氣味閾值的比值[12,36]。OAV越大,說明該香氣化合物越重要[37-39]?;衔餄舛鹊臏y(cè)定在本文第3節(jié)香氣成分定量技術(shù)部分討論。
為此,需要測(cè)定這些香氣化合物在白酒中的氣味閾值。*大規(guī)模測(cè)定白酒香氣化合物閾值文章發(fā)表于2011年,當(dāng)時(shí)組織國(guó)家ji評(píng)酒員測(cè)定了79個(gè)香氣化合物在φ=46%酒精水溶液中的氣味閾值[40],其后,不少研究人員又陸續(xù)測(cè)定了一些化合物的閾值。到目前為止,據(jù)不*統(tǒng)計(jì)共測(cè)定了143種化合物氣味閾值,包括32種酯類、15種醇類、15種醛類、2種縮醛、5種酮類、14種脂肪酸、9種吡嗪、7種呋喃類、16種芳香族、14種酚類、4種內(nèi)酯、6種含硫化合物和4種萜烯類化合物的閾值[25, 35, 40-43]。
五是關(guān)鍵香氣化合物確認(rèn)。OAV大的化合物是不是關(guān)鍵香氣需要進(jìn)行驗(yàn)證。其一是選擇一些OAV較高的化合物,進(jìn)行香氣重組(recombination)或香氣重構(gòu)(reconstitution),建立香氣模型。如果重組后的整體香氣與原有酒樣不一樣,或相似度不高,則需要從香氣物質(zhì)提取開始重新實(shí)驗(yàn);其二是通過缺失實(shí)(omission test),確定關(guān)鍵風(fēng)味成分。如果缺失某個(gè)化合物后,整體香氣與原有研究酒的香氣不同,則該化合物為關(guān)鍵香氣化合物[34-35, 44] 。
2 聞香技術(shù)
無論采用何種聞香技術(shù),參加聞香的人員必須進(jìn)行培訓(xùn)與選擇[6,34]。AEDA聞香時(shí)通常需要2~3人,每個(gè)稀釋度聞香6次(每人2~3次),只要有1人聞到香氣就認(rèn)可這個(gè)香氣存在,計(jì)算其香氣稀釋因子(flavor dilution factor,F(xiàn)D值)[14,34-35]。而Osme技術(shù)中,主要使用香氣強(qiáng)度。香氣強(qiáng)度通常有6點(diǎn)刻度法(0~5)[45]和16點(diǎn)刻度法(0~15)[13]。“0”表示沒有香氣;中間點(diǎn)“3”或“8”表示香氣強(qiáng)度中等;“5”或“15”表示香氣zui強(qiáng)[13,45] 。
2.1 AEDA法
AEDA方法由Grosch于1993年發(fā)明[12,30]。萃取濃縮后的樣品與溶按V∶V=1∶1、1∶2、1∶3比例稀釋,每一個(gè)稀釋樣品用GC-O聞香[11],結(jié)果用FD值表示。FD值是指初萃取物中呈香物質(zhì)濃度與該香味物質(zhì)稀時(shí)(GC-O仍能檢測(cè)到)濃度比。因此,F(xiàn)D值是一個(gè)相對(duì)測(cè)量值,是化合物在空氣中的OAV值。AEDA法已經(jīng)在酒類風(fēng)味研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,如豉香型白酒香氣研究[34]、洋河大曲新酒與老酒香氣研究[6]、五糧液與劍南春香氣研究[14]、清香型原酒香氣研究[20] 。
2.2 Osme技術(shù)
Osme一詞來源于希臘語,意思為“聞香(smell)”。Osme技術(shù)由McDaniel等人開發(fā)[32]。該方法是萃取獲得的樣品,不經(jīng)稀釋,直接進(jìn)行GC-O分析,記錄香氣強(qiáng)度。將感官品嘗人員記錄到的香氣強(qiáng)度進(jìn)行平均,即為香氣強(qiáng)度值,此法又稱為GC-香氣強(qiáng)度法(GC-intensity)。Osme技術(shù)考慮了斯蒂文斯法則(Stevens’s Law)[3],它測(cè)量的是香氣物質(zhì)的時(shí)間-強(qiáng)度值(time-intensity)。該技術(shù)因耗時(shí)短,已經(jīng)在白酒香氣研究中獲得廣泛應(yīng)用,如洋河大曲香氣研究[13]、洋河綿柔型白酒香氣研究[27]、清香型白酒(包括汾酒、寶豐酒和青稞酒)香氣研究[35]、茅臺(tái)與郎酒香氣研究[18]、醬香型習(xí)酒和濃香型習(xí)酒香氣研究[25, 46]、老白干香型白酒香氣研究[16]、牛欄山二鍋頭香氣研究[26]、寶豐酒香氣研究[47]、藥香型董酒香氣研究[19]、豉香型白酒香氣研究[48]、兼香型白酒香氣研究[17]、白酒異嗅物研究[21]。
3 香氣成分定量技術(shù)
精確定量白酒中香氣成分是件十分困難的事。白酒中香氣成分眾多,化學(xué)性質(zhì)不一;濃度千差萬別,從ng/L至g/L。因此,對(duì)白酒化合物定量通常需要幾個(gè)方法結(jié)合使用。對(duì)濃度較高的化合物,如己酸乙酯(濃香型等香型)、乙酸乙酯、乳酸乙酯等(幾百mg/L至g/L),通常采用直接進(jìn)樣GC-FID測(cè)定[25];而對(duì)于濃度較低的化合物(μg/L至幾十mg/L),通常采用HS-SPME[25]或攪拌子吸附萃取技術(shù)(stir bar sorptive extraction,SBSE)測(cè)定[49]。而對(duì)于一些特殊化合物如含氮化合物,則采用檢測(cè)器氮磷檢測(cè)器(NPD)測(cè)定[50];另外一些化合物如反-2-烯醛類化合物需要衍生化后測(cè)定[34]。
3.1 直接進(jìn)樣GC-FID
白酒中一些高濃度香氣化合物可以采用此法測(cè)定,主要包括濃香型和醬香型白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、正丁醇、2-甲基丙醇(異丁醇)、3-甲基丁醇(異戊醇)[25];清香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯[35];豉香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇[34];芝麻香型白酒中的乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇和乙縮醛[39]。因測(cè)定的化合物大部分為酯類,故采用乙酸戊酯作內(nèi)標(biāo)[25,34-35]。該法還可以直接定量白酒中的乙醛與乙縮醛,此時(shí)使用辛醛-d16作內(nèi)標(biāo)[51]。
另外一些化合物也可以采用GC-FID檢測(cè),如乙醛和乙縮醛,此時(shí)可用辛醛-d16作內(nèi)標(biāo)[51]。
3.2 LLE和液液微萃取
LLE與GC-MS結(jié)合后可用于化合物定量分析,如地衣芽孢桿菌發(fā)酵液成分檢測(cè)[52],高濃度硫化物檢測(cè)等[53]。
液液微萃取(liquid-liquid microextraction,LLME)是一種環(huán)境友好的技術(shù)[54]。LLME結(jié)合GC-MS采用選擇離子法(selective ion monitoring,SIM)通常定量mg/L級(jí)化合物[25,55]。該法在醬香型白酒中可一次性定量48種香氣化合物,包括酯類13種、醇類11種、酸類9種、芳香族化合物9種、呋喃類化合物4種、醛酮類1種以及吡嗪類化合物1種。乙酸乙酯、乙縮醛、丙酸乙酯因溶劑延遲無法定性與定量;乙醛因揮發(fā)性太強(qiáng),無法使用LLME方法定量[55]。該法目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于白酒定量中,如醬香型[25,55]、濃香型[25]、清香型[35]、芝麻香型[56]白酒。另外,因SPME萃取頭對(duì)脂肪酸不敏感,故脂肪酸類化合物可以采用LLME法測(cè)定[39]。
3.3 SPME結(jié)合GC-MS
SPME技術(shù)于1989年由Belardi和Pawliszyn[57]開發(fā),已經(jīng)被廣泛用于食品風(fēng)味物質(zhì)研究[58],主要用于定量μg/L級(jí)化合物。該技術(shù)可用于以下分析:一種是頂空分析,即HS-SPME,2005年HS-SPME*應(yīng)用于白酒風(fēng)味研究[6],后該技術(shù)結(jié)合GC-MS在我國(guó)白酒風(fēng)味研究中獲得廣泛應(yīng)用,如醬香型[18,25]、濃香型[25]、豉香型[34]、芝麻香型[39,59]白酒風(fēng)味研究;白酒中異嗅物分析[21,60]。
另外一種是浸入式SPME技術(shù)(direct immersion-SPME,DI-SPME)。2007年DI-SPME技術(shù)應(yīng)用于我國(guó)白酒風(fēng)味成分定量[61],后又應(yīng)用于白酒中異嗅化合物[62]、游離揮發(fā)性酚類[63]以及揮發(fā)性香氣物質(zhì)[64]定量。
3.4 SBSE結(jié)合GC-MS
SBSE技術(shù)由比利時(shí)色譜研究所Baltussen和Sandra等[65-66]于1999年開發(fā),與其類似的技術(shù)攪拌子頂空吸附萃取技術(shù)(headspace sorptive extraction,HSSE)則由Bicchi和Tienpont等[67-68]首先應(yīng)用。SBSE技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品分析中[69-73]。2011年,這一技術(shù)被用于醬香型茅臺(tái)與郎酒的香氣成分分析[49],一次可以定量76個(gè)揮發(fā)性成分,包括25種酯、10種醇、9種醛和酮、8種芳香族、5種呋喃、3種含氮化合物、6種脂肪酸、4種酚類、3種萜烯、1種含硫化合物、1種內(nèi)酯和1種縮醛。
3.5 固相萃取結(jié)合GC-MS
固相萃取(solid phase extraction,SPE)己被*為是一個(gè)非常有用的樣品預(yù)處理技術(shù),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飲料酒成分分析中,如葡萄酒、威士忌、白蘭地[74] 以及結(jié)合態(tài)風(fēng)味化合物 [75-76] 研究中。SPE可以用于白酒香氣成分預(yù)處理,即選擇某一吸附材料,吸附白酒香氣物質(zhì),再洗脫、濃縮后用于GC-O分析 [77] ;SPE結(jié)合GC-MS技術(shù)可以定量白酒中香氣物質(zhì)如定量8種內(nèi)酯 [78] ,包括γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-庚內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-癸內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯;或定量白酒中其他風(fēng)味物質(zhì) [79] 。
3.6 檢測(cè)器測(cè)定技術(shù)
白酒中含氮、硫化合物,因FID或MS檢測(cè)器響應(yīng)不靈敏,需要使用檢測(cè)器進(jìn)行定性和定量。
氮磷檢測(cè)器(nitrogen-phosphorus detector,NPD)可用于檢測(cè)白酒中吡嗪類化合物[50]。NPD俗稱堿火焰離子化檢測(cè)器(alkali flame ionization detector,AFID)、熱離子離子化檢測(cè)器(thermionic ionization detector,TID)、火焰熱離子化檢測(cè)器(flame thermionic detector,F(xiàn)TD)、熱離子化檢測(cè)器(thermionic specific detector,TSD),于1964年被Karmen和Giuffrida發(fā)明[80]。應(yīng)用GC-NPD并結(jié)合GC-MS,可以定性白酒中26種吡嗪類化合物,在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下能用于定量分析[50]。
火焰光度檢測(cè)器(flame photometric detector,F(xiàn)PD)是在FID基礎(chǔ)上于1966年發(fā)明的[80],目前已經(jīng)發(fā)展成為脈沖火焰光度檢測(cè)器(pulsed flame photometric detector,PFPD)。GC-FPD/PFPD已經(jīng)用于白酒硫化物檢測(cè)[59,81-82],如GC-FPD可以測(cè)定白酒中近20種硫化物[81]。GC-PFPD可以檢測(cè)茅臺(tái)酒中13種硫化物[82]。
3.7 衍生化測(cè)定技術(shù)
不飽和醛如反-2-烯醛和二烯醛是豉香型白酒重要香氣成分[34],由于這些化合物含量低,常規(guī)方法無法檢測(cè),因此,需要衍生化后進(jìn)行檢測(cè)。使用O-(2,3,4,5,6-五氟苯)羥胺鹽酸鹽(O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride,PFBHA)作為衍生化試劑,p-氟苯甲quan作內(nèi)標(biāo)(p-fluorobenzaldehyde),HS-SPME結(jié)合GC-MS同時(shí)萃取衍生化可測(cè)定反-2-戊、己、庚、辛、壬烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-辛二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛等[83]。
當(dāng)然,由于羰基會(huì)與PFBHA反應(yīng),故該衍生化方法能定性白酒中53種羰基化合物,可定量除乙醛和丙酮外的51種羰基化合物,包括11種直鏈飽和脂肪醛、3種支鏈飽和脂肪醛、14種不飽和脂肪醛、8種飽和脂肪酮、6種芳香族羰基化合物、4種呋喃類羰基化合物以及5種其他羰基化合物[84-85]。與常規(guī) HS-SPME定量方法相比,多定量43種化合物,檢測(cè)限低達(dá)到0.01μg/L,即10ng/L(反-2-庚烯醛)[85]。
3.8 全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)
全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(comprehensive two-GC-time of flight-MS,GC×GC-TOF-MS)于1985年由Phillips等[86-87]發(fā)明。這一技術(shù)解決了一維GC不能將眾多化合物分離的問題。目前這一技術(shù)已經(jīng)在白酒硫化物[88]、白酒風(fēng)味成分[89]研究等方面得到應(yīng)用。
4 香氣重組與缺失技術(shù)
定量了活性香氣化合物濃度,測(cè)定它們?cè)?/span>φ=46%酒精水溶液中的嗅閾值,則可以計(jì)算出OAV值。將計(jì)算后的OAV值從大到小排序。在白酒香氣重組時(shí),通常忽略O(shè)AV小于1的化合物,而使用OAV大于1的化合物進(jìn)行香氣重組,如豉香型白酒香氣研究中,共檢測(cè)到56個(gè)活性香氣成分,但僅采用34個(gè)OAV大于1的化合物進(jìn)行重組[34];在清香型汾酒香氣研究中,共檢測(cè)到66個(gè)活性香氣成分,僅采用27個(gè)OAV大于1的化合物進(jìn)行香氣重組[35];在濃香型劍南春酒香氣研究中,共檢測(cè)到126個(gè)活性香氣成分[14],后選取40個(gè)化合物進(jìn)行香氣重組[44] 。
當(dāng)重組后的φ=46%酒精水溶液香氣與初的樣品香氣相似時(shí),即可認(rèn)為香氣重組成功,此時(shí),可進(jìn)行缺失實(shí)驗(yàn)。缺失實(shí)驗(yàn)是將用于重組的化合物逐一省略,重組出少一個(gè)化合物的新樣品,并逐一進(jìn)行聞香判別。當(dāng)某一化合物缺失后,重組樣品的香氣與原酒樣差距大或有顯著性差異時(shí),即可認(rèn)為該化合物是關(guān)鍵香氣化合物[12] 。
然而,由于白酒重組香氣成分較多,逐一缺失時(shí),會(huì)造成工作量特別是聞香工作量太大。故通常選擇缺少一類化合物如酯類或醇類化合物。如果某類化合物缺失后,造成重組樣品香氣與原有酒樣香氣顯著不同,則在此類化合物中再逐一缺失[34-35,44]。
5 研究展望
目前,大部分香型白酒的活性香氣成分已經(jīng)得到廣泛研究,但能夠香氣重組的香型并不多?;蛟S,在樣品預(yù)處理上仍然存在一些缺陷;或沒有提取或分離出應(yīng)該提取或分離的香氣成分;或在GC-O階段,某個(gè)香氣組分的香氣被其它成分所掩蓋;或者這個(gè)香氣成分處于聞香的后段,即化合物的RI值較高,且化合物不出峰,造成無法鑒定;或者這個(gè)香型的關(guān)鍵香氣是幾種香氣化合物協(xié)同作用的結(jié)果。要解決這些問題,需要開發(fā)一些新的研究策略來研究這些白酒的活性香氣成分。但不管如何,后仍然需要定量、閾值測(cè)定、計(jì)算OAV,并進(jìn)行香氣重組與缺失試驗(yàn)。
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